Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.
Klionsky DJ., Abdalla FC., Abeliovich H., Abraham RT., Acevedo-Arozena A., Adeli K., Agholme L., Agnello M., Agostinis P., Aguirre-Ghiso JA., Ahn HJ., Ait-Mohamed O., Ait-Si-Ali S., Akematsu T., Akira S., Al-Younes HM., Al-Zeer MA., Albert ML., Albin RL., Alegre-Abarrategui J., Aleo MF., Alirezaei M., Almasan A., Almonte-Becerril M., Amano A., Amaravadi R., Amarnath S., Amer AO., Andrieu-Abadie N., Anantharam V., Ann DK., Anoopkumar-Dukie S., Aoki H., Apostolova N., Arancia G., Aris JP., Asanuma K., Asare NYO., Ashida H., Askanas V., Askew DS., Auberger P., Baba M., Backues SK., Baehrecke EH., Bahr BA., Bai X-Y., Bailly Y., Baiocchi R., Baldini G., Balduini W., Ballabio A., Bamber BA., Bampton ETW., Bánhegyi G., Bartholomew CR., Bassham DC., Bast RC., Batoko H., Bay B-H., Beau I., Béchet DM., Begley TJ., Behl C., Behrends C., Bekri S., Bellaire B., Bendall LJ., Benetti L., Berliocchi L., Bernardi H., Bernassola F., Besteiro S., Bhatia-Kissova I., Bi X., Biard-Piechaczyk M., Blum JS., Boise LH., Bonaldo P., Boone DL., Bornhauser BC., Bortoluci KR., Bossis I., Bost F., Bourquin J-P., Boya P., Boyer-Guittaut M., Bozhkov PV., Brady NR., Brancolini C., Brech A., Brenman JE., Brennand A., Bresnick EH., Brest P., Bridges D., Bristol ML., Brookes PS., Brown EJ., Brumell JH., Brunetti-Pierri N., Brunk UT., Bulman DE., Bultman SJ., Bultynck G., Burbulla LF., Bursch W., Butchar JP., Buzgariu W., Bydlowski SP., Cadwell K., Cahová M., Cai D., Cai J., Cai Q., Calabretta B., Calvo-Garrido J., Camougrand N., Campanella M., Campos-Salinas J., Candi E., Cao L., Caplan AB., Carding SR., Cardoso SM., Carew JS., Carlin CR., Carmignac V., Carneiro LAM., Carra S., Caruso RA., Casari G., Casas C., Castino R., Cebollero E., Cecconi F., Celli J., Chaachouay H., Chae H-J., Chai C-Y., Chan DC., Chan EY., Chang RC-C., Che C-M., Chen C-C., Chen G-C., Chen G-Q., Chen M., Chen Q., Chen SS-L., Chen W., Chen X., Chen X., Chen X., Chen Y-G., Chen Y., Chen Y., Chen Y-J., Chen Z., Cheng A., Cheng CHK., Cheng Y., Cheong H., Cheong J-H., Cherry S., Chess-Williams R., Cheung ZH., Chevet E., Chiang H-L., Chiarelli R., Chiba T., Chin L-S., Chiou S-H., Chisari FV., Cho CH., Cho D-H., Choi AMK., Choi D., Choi KS., Choi ME., Chouaib S., Choubey D., Choubey V., Chu CT., Chuang T-H., Chueh S-H., Chun T., Chwae Y-J., Chye M-L., Ciarcia R., Ciriolo MR., Clague MJ., Clark RSB., Clarke PGH., Clarke R., Codogno P., Coller HA., Colombo MI., Comincini S., Condello M., Condorelli F., Cookson MR., Coombs GH., Coppens I., Corbalan R., Cossart P., Costelli P., Costes S., Coto-Montes A., Couve E., Coxon FP., Cregg JM., Crespo JL., Cronjé MJ., Cuervo AM., Cullen JJ., Czaja MJ., D'Amelio M., Darfeuille-Michaud A., Davids LM., Davies FE., De Felici M., de Groot JF., de Haan CAM., De Martino L., De Milito A., De Tata V., Debnath J., Degterev A., Dehay B., Delbridge LMD., Demarchi F., Deng YZ., Dengjel J., Dent P., Denton D., Deretic V., Desai SD., Devenish RJ., Di Gioacchino M., Di Paolo G., Di Pietro C., Díaz-Araya G., Díaz-Laviada I., Diaz-Meco MT., Diaz-Nido J., Dikic I., Dinesh-Kumar SP., Ding W-X., Distelhorst CW., Diwan A., Djavaheri-Mergny M., Dokudovskaya S., Dong Z., Dorsey FC., Dosenko V., Dowling JJ., Doxsey S., Dreux M., Drew ME., Duan Q., Duchosal MA., Duff K., Dugail I., Durbeej M., Duszenko M., Edelstein CL., Edinger AL., Egea G., Eichinger L., Eissa NT., Ekmekcioglu S., El-Deiry WS., Elazar Z., Elgendy M., Ellerby LM., Eng KE., Engelbrecht A-M., Engelender S., Erenpreisa J., Escalante R., Esclatine A., Eskelinen E-L., Espert L., Espina V., Fan H., Fan J., Fan Q-W., Fan Z., Fang S., Fang Y., Fanto M., Fanzani A., Farkas T., Farré J-C., Faure M., Fechheimer M., Feng CG., Feng J., Feng Q., Feng Y., Fésüs L., Feuer R., Figueiredo-Pereira ME., Fimia GM., Fingar DC., Finkbeiner S., Finkel T., Finley KD., Fiorito F., Fisher EA., Fisher PB., Flajolet M., Florez-McClure ML., Florio S., Fon EA., Fornai F., Fortunato F., Fotedar R., Fowler DH., Fox HS., Franco R., Frankel LB., Fransen M., Fuentes JM., Fueyo J., Fujii J., Fujisaki K., Fujita E., Fukuda M., Furukawa RH., Gaestel M., Gailly P., Gajewska M., Galliot B., Galy V., Ganesh S., Ganetzky B., Ganley IG., Gao F-B., Gao GF., Gao J., Garcia L., Garcia-Manero G., Garcia-Marcos M., Garmyn M., Gartel AL., Gatti E., Gautel M., Gawriluk TR., Gegg ME., Geng J., Germain M., Gestwicki JE., Gewirtz DA., Ghavami S., Ghosh P., Giammarioli AM., Giatromanolaki AN., Gibson SB., Gilkerson RW., Ginger ML., Ginsberg HN., Golab J., Goligorsky MS., Golstein P., Gomez-Manzano C., Goncu E., Gongora C., Gonzalez CD., Gonzalez R., González-Estévez C., González-Polo RA., Gonzalez-Rey E., Gorbunov NV., Gorski S., Goruppi S., Gottlieb RA., Gozuacik D., Granato GE., Grant GD., Green KN., Gregorc A., Gros F., Grose C., Grunt TW., Gual P., Guan J-L., Guan K-L., Guichard SM., Gukovskaya AS., Gukovsky I., Gunst J., Gustafsson AB., Halayko AJ., Hale AN., Halonen SK., Hamasaki M., Han F., Han T., Hancock MK., Hansen M., Harada H., Harada M., Hardt SE., Harper JW., Harris AL., Harris J., Harris SD., Hashimoto M., Haspel JA., Hayashi S-I., Hazelhurst LA., He C., He Y-W., Hébert M-J., Heidenreich KA., Helfrich MH., Helgason GV., Henske EP., Herman B., Herman PK., Hetz C., Hilfiker S., Hill JA., Hocking LJ., Hofman P., Hofmann TG., Höhfeld J., Holyoake TL., Hong M-H., Hood DA., Hotamisligil GS., Houwerzijl EJ., Høyer-Hansen M., Hu B., Hu C-AA., Hu H-M., Hua Y., Huang C., Huang J., Huang S., Huang W-P., Huber TB., Huh W-K., Hung T-H., Hupp TR., Hur GM., Hurley JB., Hussain SNA., Hussey PJ., Hwang JJ., Hwang S., Ichihara A., Ilkhanizadeh S., Inoki K., Into T., Iovane V., Iovanna JL., Ip NY., Isaka Y., Ishida H., Isidoro C., Isobe K-I., Iwasaki A., Izquierdo M., Izumi Y., Jaakkola PM., Jäättelä M., Jackson GR., Jackson WT., Janji B., Jendrach M., Jeon J-H., Jeung E-B., Jiang H., Jiang H., Jiang JX., Jiang M., Jiang Q., Jiang X., Jiang X., Jiménez A., Jin M., Jin S., Joe CO., Johansen T., Johnson DE., Johnson GVW., Jones NL., Joseph B., Joseph SK., Joubert AM., Juhász G., Juillerat-Jeanneret L., Jung CH., Jung Y-K., Kaarniranta K., Kaasik A., Kabuta T., Kadowaki M., Kagedal K., Kamada Y., Kaminskyy VO., Kampinga HH., Kanamori H., Kang C., Kang KB., Kang KI., Kang R., Kang Y-A., Kanki T., Kanneganti T-D., Kanno H., Kanthasamy AG., Kanthasamy A., Karantza V., Kaushal GP., Kaushik S., Kawazoe Y., Ke P-Y., Kehrl JH., Kelekar A., Kerkhoff C., Kessel DH., Khalil H., Kiel JAKW., Kiger AA., Kihara A., Kim DR., Kim D-H., Kim D-H., Kim E-K., Kim H-R., Kim J-S., Kim JH., Kim JC., Kim JK., Kim PK., Kim SW., Kim Y-S., Kim Y., Kimchi A., Kimmelman AC., King JS., Kinsella TJ., Kirkin V., Kirshenbaum LA., Kitamoto K., Kitazato K., Klein L., Klimecki WT., Klucken J., Knecht E., Ko BCB., Koch JC., Koga H., Koh J-Y., Koh YH., Koike M., Komatsu M., Kominami E., Kong HJ., Kong W-J., Korolchuk VI., Kotake Y., Koukourakis MI., Kouri Flores JB., Kovács AL., Kraft C., Krainc D., Krämer H., Kretz-Remy C., Krichevsky AM., Kroemer G., Krüger R., Krut O., Ktistakis NT., Kuan C-Y., Kucharczyk R., Kumar A., Kumar R., Kumar S., Kundu M., Kung H-J., Kurz T., Kwon HJ., La Spada AR., Lafont F., Lamark T., Landry J., Lane JD., Lapaquette P., Laporte JF., László L., Lavandero S., Lavoie JN., Layfield R., Lazo PA., Le W., Le Cam L., Ledbetter DJ., Lee AJX., Lee B-W., Lee GM., Lee J., Lee J-H., Lee M., Lee M-S., Lee SH., Leeuwenburgh C., Legembre P., Legouis R., Lehmann M., Lei H-Y., Lei Q-Y., Leib DA., Leiro J., Lemasters JJ., Lemoine A., Lesniak MS., Lev D., Levenson VV., Levine B., Levy E., Li F., Li J-L., Li L., Li S., Li W., Li X-J., Li Y-B., Li Y-P., Liang C., Liang Q., Liao Y-F., Liberski PP., Lieberman A., Lim HJ., Lim K-L., Lim K., Lin C-F., Lin F-C., Lin J., Lin JD., Lin K., Lin W-W., Lin W-C., Lin Y-L., Linden R., Lingor P., Lippincott-Schwartz J., Lisanti MP., Liton PB., Liu B., Liu C-F., Liu K., Liu L., Liu QA., Liu W., Liu Y-C., Liu Y., Lockshin RA., Lok C-N., Lonial S., Loos B., Lopez-Berestein G., López-Otín C., Lossi L., Lotze MT., Lőw P., Lu B., Lu B., Lu B., Lu Z., Luciano F., Lukacs NW., Lund AH., Lynch-Day MA., Ma Y., Macian F., MacKeigan JP., Macleod KF., Madeo F., Maiuri L., Maiuri MC., Malagoli D., Malicdan MCV., Malorni W., Man N., Mandelkow E-M., Manon S., Manov I., Mao K., Mao X., Mao Z., Marambaud P., Marazziti D., Marcel YL., Marchbank K., Marchetti P., Marciniak SJ., Marcondes M., Mardi M., Marfe G., Mariño G., Markaki M., Marten MR., Martin SJ., Martinand-Mari C., Martinet W., Martinez-Vicente M., Masini M., Matarrese P., Matsuo S., Matteoni R., Mayer A., Mazure NM., McConkey DJ., McConnell MJ., McDermott C., McDonald C., McInerney GM., McKenna SL., McLaughlin B., McLean PJ., McMaster CR., McQuibban GA., Meijer AJ., Meisler MH., Meléndez A., Melia TJ., Melino G., Mena MA., Menendez JA., Menna-Barreto RFS., Menon MB., Menzies FM., Mercer CA., Merighi A., Merry DE., Meschini S., Meyer CG., Meyer TF., Miao C-Y., Miao J-Y., Michels PAM., Michiels C., Mijaljica D., Milojkovic A., Minucci S., Miracco C., Miranti CK., Mitroulis I., Miyazawa K., Mizushima N., Mograbi B., Mohseni S., Molero X., Mollereau B., Mollinedo F., Momoi T., Monastyrska I., Monick MM., Monteiro MJ., Moore MN., Mora R., Moreau K., Moreira PI., Moriyasu Y., Moscat J., Mostowy S., Mottram JC., Motyl T., Moussa CE-H., Müller S., Muller S., Münger K., Münz C., Murphy LO., Murphy ME., Musarò A., Mysorekar I., Nagata E., Nagata K., Nahimana A., Nair U., Nakagawa T., Nakahira K., Nakano H., Nakatogawa H., Nanjundan M., Naqvi NI., Narendra DP., Narita M., Navarro M., Nawrocki ST., Nazarko TY., Nemchenko A., Netea MG., Neufeld TP., Ney PA., Nezis IP., Nguyen HP., Nie D., Nishino I., Nislow C., Nixon RA., Noda T., Noegel AA., Nogalska A., Noguchi S., Notterpek L., Novak I., Nozaki T., Nukina N., Nürnberger T., Nyfeler B., Obara K., Oberley TD., Oddo S., Ogawa M., Ohashi T., Okamoto K., Oleinick NL., Oliver FJ., Olsen LJ., Olsson S., Opota O., Osborne TF., Ostrander GK., Otsu K., Ou J-HJ., Ouimet M., Overholtzer M., Ozpolat B., Paganetti P., Pagnini U., Pallet N., Palmer GE., Palumbo C., Pan T., Panaretakis T., Pandey UB., Papackova Z., Papassideri I., Paris I., Park J., Park OK., Parys JB., Parzych KR., Patschan S., Patterson C., Pattingre S., Pawelek JM., Peng J., Perlmutter DH., Perrotta I., Perry G., Pervaiz S., Peter M., Peters GJ., Petersen M., Petrovski G., Phang JM., Piacentini M., Pierre P., Pierrefite-Carle V., Pierron G., Pinkas-Kramarski R., Piras A., Piri N., Platanias LC., Pöggeler S., Poirot M., Poletti A., Poüs C., Pozuelo-Rubio M., Prætorius-Ibba M., Prasad A., Prescott M., Priault M., Produit-Zengaffinen N., Progulske-Fox A., Proikas-Cezanne T., Przedborski S., Przyklenk K., Puertollano R., Puyal J., Qian S-B., Qin L., Qin Z-H., Quaggin SE., Raben N., Rabinowich H., Rabkin SW., Rahman I., Rami A., Ramm G., Randall G., Randow F., Rao VA., Rathmell JC., Ravikumar B., Ray SK., Reed BH., Reed JC., Reggiori F., Régnier-Vigouroux A., Reichert AS., Reiners JJ., Reiter RJ., Ren J., Revuelta JL., Rhodes CJ., Ritis K., Rizzo E., Robbins J., Roberge M., Roca H., Roccheri MC., Rocchi S., Rodemann HP., Rodríguez de Córdoba S., Rohrer B., Roninson IB., Rosen K., Rost-Roszkowska MM., Rouis M., Rouschop KMA., Rovetta F., Rubin BP., Rubinsztein DC., Ruckdeschel K., Rucker EB., Rudich A., Rudolf E., Ruiz-Opazo N., Russo R., Rusten TE., Ryan KM., Ryter SW., Sabatini DM., Sadoshima J., Saha T., Saitoh T., Sakagami H., Sakai Y., Salekdeh GH., Salomoni P., Salvaterra PM., Salvesen G., Salvioli R., Sanchez AMJ., Sánchez-Alcázar JA., Sánchez-Prieto R., Sandri M., Sankar U., Sansanwal P., Santambrogio L., Saran S., Sarkar S., Sarwal M., Sasakawa C., Sasnauskiene A., Sass M., Sato K., Sato M., Schapira AHV., Scharl M., Schätzl HM., Scheper W., Schiaffino S., Schneider C., Schneider ME., Schneider-Stock R., Schoenlein PV., Schorderet DF., Schüller C., Schwartz GK., Scorrano L., Sealy L., Seglen PO., Segura-Aguilar J., Seiliez I., Seleverstov O., Sell C., Seo JB., Separovic D., Setaluri V., Setoguchi T., Settembre C., Shacka JJ., Shanmugam M., Shapiro IM., Shaulian E., Shaw RJ., Shelhamer JH., Shen H-M., Shen W-C., Sheng Z-H., Shi Y., Shibuya K., Shidoji Y., Shieh J-J., Shih C-M., Shimada Y., Shimizu S., Shintani T., Shirihai OS., Shore GC., Sibirny AA., Sidhu SB., Sikorska B., Silva-Zacarin ECM., Simmons A., Simon AK., Simon H-U., Simone C., Simonsen A., Sinclair DA., Singh R., Sinha D., Sinicrope FA., Sirko A., Siu PM., Sivridis E., Skop V., Skulachev VP., Slack RS., Smaili SS., Smith DR., Soengas MS., Soldati T., Song X., Sood AK., Soong TW., Sotgia F., Spector SA., Spies CD., Springer W., Srinivasula SM., Stefanis L., Steffan JS., Stendel R., Stenmark H., Stephanou A., Stern ST., Sternberg C., Stork B., Strålfors P., Subauste CS., Sui X., Sulzer D., Sun J., Sun S-Y., Sun Z-J., Sung JJY., Suzuki K., Suzuki T., Swanson MS., Swanton C., Sweeney ST., Sy L-K., Szabadkai G., Tabas I., Taegtmeyer H., Tafani M., Takács-Vellai K., Takano Y., Takegawa K., Takemura G., Takeshita F., Talbot NJ., Tan KSW., Tanaka K., Tanaka K., Tang D., Tang D., Tanida I., Tannous BA., Tavernarakis N., Taylor GS., Taylor GA., Taylor JP., Terada LS., Terman A., Tettamanti G., Thevissen K., Thompson CB., Thorburn A., Thumm M., Tian F., Tian Y., Tocchini-Valentini G., Tolkovsky AM., Tomino Y., Tönges L., Tooze SA., Tournier C., Tower J., Towns R., Trajkovic V., Travassos LH., Tsai T-F., Tschan MP., Tsubata T., Tsung A., Turk B., Turner LS., Tyagi SC., Uchiyama Y., Ueno T., Umekawa M., Umemiya-Shirafuji R., Unni VK., Vaccaro MI., Valente EM., Van den Berghe G., van der Klei IJ., van Doorn W., van Dyk LF., van Egmond M., van Grunsven LA., Vandenabeele P., Vandenberghe WP., Vanhorebeek I., Vaquero EC., Velasco G., Vellai T., Vicencio JM., Vierstra RD., Vila M., Vindis C., Viola G., Viscomi MT., Voitsekhovskaja OV., von Haefen C., Votruba M., Wada K., Wade-Martins R., Walker CL., Walsh CM., Walter J., Wan X-B., Wang A., Wang C., Wang D., Wang F., Wang F., Wang G., Wang H., Wang H-G., Wang H-D., Wang J., Wang K., Wang M., Wang RC., Wang X., Wang X., Wang Y-J., Wang Y., Wang Z., Wang ZC., Wang Z., Wansink DG., Ward DM., Watada H., Waters SL., Webster P., Wei L., Weihl CC., Weiss WA., Welford SM., Wen L-P., Whitehouse CA., Whitton JL., Whitworth AJ., Wileman T., Wiley JW., Wilkinson S., Willbold D., Williams RL., Williamson PR., Wouters BG., Wu C., Wu D-C., Wu WKK., Wyttenbach A., Xavier RJ., Xi Z., Xia P., Xiao G., Xie Z., Xie Z., Xu D-Z., Xu J., Xu L., Xu X., Yamamoto A., Yamamoto A., Yamashina S., Yamashita M., Yan X., Yanagida M., Yang D-S., Yang E., Yang J-M., Yang SY., Yang W., Yang WY., Yang Z., Yao M-C., Yao T-P., Yeganeh B., Yen W-L., Yin J-J., Yin X-M., Yoo O-J., Yoon G., Yoon S-Y., Yorimitsu T., Yoshikawa Y., Yoshimori T., Yoshimoto K., You HJ., Youle RJ., Younes A., Yu L., Yu L., Yu S-W., Yu WH., Yuan Z-M., Yue Z., Yun C-H., Yuzaki M., Zabirnyk O., Silva-Zacarin E., Zacks D., Zacksenhaus E., Zaffaroni N., Zakeri Z., Zeh HJ., Zeitlin SO., Zhang H., Zhang H-L., Zhang J., Zhang J-P., Zhang L., Zhang L., Zhang M-Y., Zhang XD., Zhao M., Zhao Y-F., Zhao Y., Zhao ZJ., Zheng X., Zhivotovsky B., Zhong Q., Zhou C-Z., Zhu C., Zhu W-G., Zhu X-F., Zhu X., Zhu Y., Zoladek T., Zong W-X., Zorzano A., Zschocke J., Zuckerbraun B.
In 2008 we published the first set of guidelines for standardizing research in autophagy. Since then, research on this topic has continued to accelerate, and many new scientists have entered the field. Our knowledge base and relevant new technologies have also been expanding. Accordingly, it is important to update these guidelines for monitoring autophagy in different organisms. Various reviews have described the range of assays that have been used for this purpose. Nevertheless, there continues to be confusion regarding acceptable methods to measure autophagy, especially in multicellular eukaryotes. A key point that needs to be emphasized is that there is a difference between measurements that monitor the numbers or volume of autophagic elements (e.g., autophagosomes or autolysosomes) at any stage of the autophagic process vs. those that measure flux through the autophagy pathway (i.e., the complete process); thus, a block in macroautophagy that results in autophagosome accumulation needs to be differentiated from stimuli that result in increased autophagic activity, defined as increased autophagy induction coupled with increased delivery to, and degradation within, lysosomes (in most higher eukaryotes and some protists such as Dictyostelium) or the vacuole (in plants and fungi). In other words, it is especially important that investigators new to the field understand that the appearance of more autophagosomes does not necessarily equate with more autophagy. In fact, in many cases, autophagosomes accumulate because of a block in trafficking to lysosomes without a concomitant change in autophagosome biogenesis, whereas an increase in autolysosomes may reflect a reduction in degradative activity. Here, we present a set of guidelines for the selection and interpretation of methods for use by investigators who aim to examine macroautophagy and related processes, as well as for reviewers who need to provide realistic and reasonable critiques of papers that are focused on these processes. These guidelines are not meant to be a formulaic set of rules, because the appropriate assays depend in part on the question being asked and the system being used. In addition, we emphasize that no individual assay is guaranteed to be the most appropriate one in every situation, and we strongly recommend the use of multiple assays to monitor autophagy. In these guidelines, we consider these various methods of assessing autophagy and what information can, or cannot, be obtained from them. Finally, by discussing the merits and limits of particular autophagy assays, we hope to encourage technical innovation in the field.